太醫院的工作經歷，有可能給他的一生帶來了重大影響，為編寫《本草綱目》打下基礎。這期間，李時珍積極地從事藥研究工作，經常出於太醫院的藥房及藥庫，認真仔細地比較、鑑別各地的藥材，蒐集了大量的資料，同時還有機會飽覽了王府和皇家珍藏的富典籍，包括《本草品彙要》。與此同時從宮廷中獲得了當時有關民間的大量本草相關資訊，並看到了許多平時難以見到的藥標本，開闊了眼界，富知識。
東璧堂是李時珍於明世宗嘉靖三十七年從太醫院還鄉後創立的堂號，辭返鄉後坐堂行醫，致力於對藥的考察研究，在此期間，以自己的字——東璧為堂號，創立了東璧堂。
李時珍在數十年行醫以及閱讀古典醫籍的過程中，發現古代本草書中存在著不錯誤，決心重新編纂一部本草書籍。明世宗嘉靖三十一年，李時珍著手開始編寫《本草綱目》，以《證類本草》為藍本，參考了八百多部書籍，其間，從嘉靖四十四年起，多次離家外出考察，足跡遍及湖廣、江西、直隸許多名山大川，弄清了許多疑難問題。
在編寫《本草綱目》的過程中，最使李時珍頭痛的就是由於藥名混雜，往往弄不清藥的形狀和生長的況。過去的本草書，雖然作了反覆的解釋，但是由於有些作者沒有深實際進行調查研究，而是在書本上抄來抄去，所以越解釋越糊塗，而且矛盾百出，使人莫衷一是。例如藥遠志，南北朝著名醫藥學家陶弘景說它是小草，像麻黃，但青，開白花，宋代馬志卻認為它像大青，並責備陶弘景本不認識遠志。又如狗脊一藥，有的說它像萆薢，有的說它像拔葜，有的又說它像貫眾，說法很不一致。在他父親的啟示下，李時珍認識到，“讀萬卷書”固然需要，但“行萬里路”更不可。於是，他既“蒐羅百氏”，又“採訪四方”，深實際進行調查。
經過二十七年的長期努力，於明神宗萬曆六年完《本草綱目》初稿，時年六十一歲。以後又經過十年三次修改，前後共計四年。後得文學家、南京刑部尚書王世貞作序，明萬曆二十一年金陵胡承龍刊刻的《本草綱目》為《本草綱目》最早版本，也是迄今唯一由李氏家族自編的版本。
學思想：李時珍臨證，推崇張元素，重辨病證，立法嚴謹，用藥得當。治療時，或化裁古方，或自組新方，或用民間單驗方，多有良效。李時珍的學思想和研究方法很有特，他在新的歷史條件下，以自己的實踐經驗為基礎，改善了古代科學方法，積累了科學研究的新經驗。李時珍功地運用了觀察和實驗、比較和分類、分析和綜合、批判繼承和歷史考證方法。
觀察和試驗是本草藥研究的基本方法。李時珍對藥採用親自採集、仔細觀察，以得其真的方法，獲得很大功。分類是科學研究的重要任務，分類使藥研究系化，關鍵還是如何確立分類的標準。李時珍打破本草學沿用已久的上中下三品分類法，建立了三界十六部分類法，使分類系更為科學化。此外，他還在陶弘景主治藥分類法基礎上，建立了更完善的百病主治藥分類法，創立了藥歸經分類法。
李時珍為弄清每味藥，提出釋名、集解、辨疑、正誤、修治、氣味、主治、發明、附方八項任務，這八項不是每味藥全有，有的五項、六項不等。實際上是對每味藥既作出系統分析，又進行了全面綜合，而在分析基礎上，又作了高度概括和綜合。
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